使用20倍高数值孔径（NA）相衬物镜对塑料底培养皿孵育活细胞的荧光、相衬和生物发光成像

简介
塑料底培养皿培养干细胞的成像

很多培养箱制造商通常销售用于活细胞荧光观察的玻璃底培养皿。但是，某些类型的细胞无法在玻璃表面成功培养，这样需要使用塑料底培养皿。
某些类型的干细胞，例如iPS细胞（诱导性多能干细胞）和ES细胞（胚胎干细胞），在塑料基质上培养时，能够更好地分化为靶细胞。实际上，在玻璃底培养皿中培养时，某些细胞类型根本无法分化为靶细胞。然而，塑料底培养皿的缺点在于，塑料材料产生的自发荧光常常造成很大程度的背景信号，让荧光成像变得复杂。发生这种情况时，信噪比将会受到影响，并且荧光样品成像变得更加困难。
干细胞研究人员希望在使用塑料底培养皿时也能够进行逼真的荧光观察。为了满足这种需求，奥林巴斯研发出与传统20X相衬物镜相比数值孔径大大提高的20X高数值孔径相衬物镜（UCPLFLN20XPH）。经过改进的数值孔径能够获得更好的信噪比，从而可以使用塑料培养皿更好地进行荧光成像。其结果，研究人员可以通过荧光延时成像更有效地观察干细胞分化过程，并且更容易评估在塑料底培养皿中培养细胞的融合度或转染率。
在本应用指南中，我们介绍了奥林巴斯20X高数值孔径相衬物镜如何在塑料底培养皿中实现干细胞的逼真荧光和相衬观察，以及使用同一物镜进行生物发光成像观察的示例。

应用：使用奥林巴斯20X高数值孔径相衬物镜进行荧光和相衬观察

在塑料底培养皿中孵育细胞核中带有GFP标记组蛋白（GFP-H2B）的小鼠胚胎干（ES）细胞。这些细胞使用常规20X相衬物镜（NA = 0.4）成像，然后与奥林巴斯20X高数值孔径（NA = 0.7）相衬物镜拍摄的图像进行比较。 

表达GFP-H2B的小鼠ES细胞

比较上面的图像时，使用20倍高数值孔径相衬物镜（UCPLFLN20XPH）可获得明亮的荧光图像，并且易于观察到核仁。其原因在于以下事实：物镜提高了数值孔径，同时保留较长的工作距离（W.D.：0.8–1.8 mm）。
这些图像表明，当使用UCPLFLN20XPH物镜时，可以获得与使用玻璃底培养皿所获图像相当的荧光图像。利用校正环可以轻松校正由于塑料培养皿底部厚度差异产生的球差。

拍摄条件：
标本：小鼠ES细胞
荧光标记：GFP-H2B
培养箱：塑料底培养皿
物镜：高数值孔径相衬物镜UCPLFLN20XPH 
CCD相机：数码显微镜相机DP80
显微镜：倒置显微镜IX73

应用：使用DP80数码显微镜相机的单色CCD模式提高采集荧光信号的灵敏度

如上所述，奥林巴斯高数值孔径 20X相衬物镜（UCPLFLN20XPH）能够进行逼真的塑料底培养皿培养细胞的荧光和相衬观察。然而，实验过程中从培养箱中反复取出培养皿检查样品荧光时，需要将激发光产生的光毒性尽可能降低。在这种情况下，使用高灵敏度CCD相机可以减少激发光强度，同时减少样品暴露在潜在细胞毒性光条件的时间。
奥林巴斯DP80数码显微镜相机具有高色彩还原性和高灵敏度单色CCD成像的双重功能。通过将DP80单色CCD模式与20倍高数值孔径相衬物镜（UCPLFLN20XPH）结合使用，可以在较低光强度下有效检测小鼠iPS细胞中表达的Nanog-GFP，如下图所示。

Nanog-GFP表达的小鼠iPS细胞

拍摄条件：
标本：小鼠iPS细胞
荧光标记：Nanog-GFP
培养箱：塑料底培养皿
物镜：高数值孔径相衬物镜UCPLFLN20XPH 
CCD相机：DP80数码显微镜相机
显微镜：倒置显微镜IX73

应用：高性能生物发光成像

奥林巴斯20X高数值孔径相衬物镜（UCPLFLN20XPH）为要求苛刻的应用（如使用塑料底培养皿的生物发光成像）提供出色的性能。生物发光成像让用户能够定量检测单细胞水平的基因表达。使用奥林巴斯LV200（用于生物发光成像的显微镜）轻松实现这种成像方式。将UCPLFLN20XPH物镜与LV200一起使用时，可以在单一视野中观察到多个细胞。如下图所示，可以轻松地在小鼠ES细胞中以单细胞水平进行相衬和Nanog-Luc生物发光（黄色）观察。

拍摄条件：
标本：小鼠ES细胞
生物发光：Nanog-Luc
培养箱：塑料底培养皿
物镜：高数值孔径相衬物镜UCPLFLN20XPH
显微镜：LV200生物发光成像系统

结论

所讨论的示例表明，奥林巴斯20X高数值孔径相衬物镜（UCPLFLN20XPH）可以对塑料底培养皿培养的细胞进行逼真的荧光、相衬和生物发光成像。UCPLFLN20XPH物镜可与IX3-ZDC2 Z漂移补偿器和IX3系列电动倒置研究型显微镜兼容使用。配备电动载物台时，可为塑料底培养皿轻松配置全电动细胞分析化验系统。