优化图像采集实现肿瘤微球的高通量3D分析

摘要

在本应用指南中，我们介绍通过确定共聚焦显微镜的最佳图像采集设置获得肿瘤微球3D分析所需的高质量高速图像。使用InSphero的3D InSight™微组织孔板进行高通量药物疗效评估。

・药物评估工作流程

・成像条件的优化

优点

• 优化FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜的采集设置，从而获得具有NoviSight™3D分析所要求质量的高速图像。
• 由于能够利用来自基于高信噪比细胞核信号已识别对象的信号信息，因此NoviSight软件可以分析低画质的对象。
   

引言

由于其体现了癌症体内复杂的微环境，使用三维肿瘤微球评估药物性能非常重要。研究人员由此能够在更加类似肿瘤自然环境的条件下评估药物的有效性。

但是，获取大量样品的光学切片可能非常耗时。为了加快该工作流程，针对获得具备NoviSight™3D分析所要求质量的图像，我们确定了FLUOVIEW™FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜进行高速图像采集的最佳参数设置。 

通过优化包括镜头校正环、最佳步进和平均次数等采集条件，我们在56分钟23秒使用Akura™384孔板（InSphero）捕捉了252个3D InSight™显微组织样品的光学切片。NoviSight软件让我们能够准确分析FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜高速采集的多个样品图像
 

方法

样品的制备

Akura™384孔板中的3D InSight™肿瘤微组织由InSphero提供。带有绿色荧光蛋白标签的细胞系HCT-116（人结肠直肠癌）与NIH3T3-RFP成纤维细胞聚集在一起。使用每种参考化合物进行7天处理（第0天给药，第4天重新给药）。图1.显示为孔板布局和测试化合物列表。药物处理后，我们用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤3次样品，并用4％多聚甲醛溶液在4°C（39.2°F）下固定过夜。然后，我们用1x PBS溶液洗涤样品，在0.1％TritonX-100溶液中用1μMTO-PRO-3（Thermo Fisher Scientific）染色，然后在37°C下与SCALEVIEW-S4透明化试剂一起隔夜孵育。 （98.6°F）。

图1.为孔板布局和测试化合物列表。

成像和分析

为了避免在实验中出现RFP和TO-PRO-3串扰，图像以时序模式采集（需要两倍的时间）。 
在分析中，来自所有细胞（TO-PRO-3）的荧光信号让我们能够识别细胞核。根据GFP和红色荧光蛋白（RFP）信号，将所有细胞分类为HCT-116细胞或NIH3T3细胞。
 

结果

优化物镜校正环

首先，对物镜校正环（CC）进行优化，从而可以获得具有高分辨率和高对比度的3D图像。使用具有长工作距离和高数值孔径（NA）的UCPLFLN20X物镜进行成像。通过从下端一点一点转动刻度盘的方式调整到具有最佳对比度的位置，我们发现了最佳条件为CC = 0.17（图2）。结果，我们将CC调整为0.17，并使用UCPLFLN20X物镜观察Akura™384孔板。

图2.优化物镜校正环（比例尺= 100μm）

优化Z轴步进

接下来，我们使用NoviSight™软件检查了Z轴步进对对象识别和分析的影响。结果表明，识别准确性与步进呈正比下降（图3）。使用作为Z轴分辨率一半的最小步进（1.28μm）作为基准。分类后，每个细胞数在最小步进（1.28μm）和3μm（学生t检验）之间不存在显著差异。细胞核大小约为10μm，因此使用该步进可以为每个细胞核采集约三张图像。

图3.优化步进

优化平均时间（共振扫描模式）

FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜共振扫描的图像质量与平均次数有关。为了获得NoviSight分析所需的图像质量，我们对平均次数进行了优化。NoviSight软件使用荧光信号识别所要分析的对象，因此无需使用高分辨率图像。该实验使用具有高信噪比的细胞核进行对象识别，因此只需获取其他通道（GFP / RFP）中的强度信息就足够了。当我们将galvano振镜扫描的识别准确度与共振扫描的平均图像进行比较时，即使不进行平均（学生t检验），识别准确度也与对照几乎相同（图4）。在本实验中，我们验证确定图像质量无需取平均即足以进行NoviSight分析。

图4.优化平均次数

在优化条件下成像

通过优化上述条件（图5A），我们可以在56分钟23秒内在Akura™384孔板（InSphero）中采集252个3D InSight™显微组织样品（图5B）。结果表明，每种药物均以剂量反应方式抑制微球细胞的生长。此外，使用高浓度Sunitinib（一种抑制血管内皮生长因子（VEGF）的分子靶向药物）处理可显著降低绿色荧光蛋白（GFP）的强度，表明其仅影响癌细胞（带有GFP标签的HCT-116）。

分析

检测到细胞后（图6A），可使用NoviSight™软件上的热图（图6B）轻松确定每个微球中的细胞总数。分类后，计算并绘制相对细胞数的百分比（图6C）。分析结果表明，Sunitinib会影响癌细胞的生长（HCT-116，IC50 = 1.46μM）。在最佳条件下，通过使用FV3000RS系统高速成像足以完成3D药物评估。

(C)

Fig. 6 Three-dimensional efficacy drug evaluation

结论

在针对高通量成像优化的条件下，使用FV3000RS激光扫描共聚焦显微镜对Akura™384孔板（InSphero）中的252个3D InSight™显微组织样品进行了成像。本研究表明成像可以在一小时内完成，并且可以执行NoviSight 3D分析。通过调整染料组合和样品大小可以进一步提高生产率。

作者

Hiroya Ishihara,，生物评价技术2，研究开发
Takashi Sugiyama，生物评价技术2，研究开发