荧光图像分析——微球中的细胞分裂

微球内部的细胞分裂可以通过染色细胞核和微管来观察。可以使用激光共聚焦显微镜和NoviSight™软件的计数模块对所采集的图像中微球有丝分裂的细胞数量进行定量评估。

目的

通过测量有丝分裂中的细胞数量或非典型有丝分裂中的细胞数量评估癌症组织的恶性程度。有丝分裂中癌细胞的数量通常通过流式细胞仪计数。使用该技术时，无论2D还是3D细胞培养，均通过将癌组织消化并进行细胞核染色对有丝分裂中的细胞数进行计数。但是，由于流式细胞仪无法观察到组织的原始3D结构，因此无法确定癌症组织内有丝分裂细胞的位置。分析诸如肿瘤大小与细胞分裂之间关系的形态学信息也存在很大难度。本研究通过先进行细胞核和微管染色，然后进行组织透明化，成功实现了完整肿瘤微球内有丝分裂细胞的可视化观察。这项技术与NoviSight™软件配合使用，让我们能够计算有丝分裂中的细胞数。通过对图像进行定量分析，即可确定有丝分裂中和非典型有丝分裂中细胞的位置。

样品的制备

HT-29的细胞悬液以500个细胞/孔的密度种入PrimeSurface® 96U孔板（SUMITOMO BAKELITE CO., LTD）中。培养5天后，细胞形成微球结构，我们使用各种浓度的紫杉醇对微球进行处理。加入紫杉醇后，将微球孵育48小时，并用4％多聚甲醛固定。细胞核和微管分别用Hoechst33342（DOJINDO）和Alexa Fluor 488偶联的抗微管蛋白抗体（eBioscience）染色。将染色微球用组织透明化试剂ScaleS在37°C下过夜处理。

结论
荧光图像的采集和分析

使用FV3000激光扫描共聚焦激光扫描显微镜可以获得微球的荧光图像。在未经处理的对照组中，在微球表面的三个细胞层观察到由微管形成的纺锤体，这是有丝分裂细胞的特定特征（A）。使用NoviSight™软件计算对照组和紫杉醇处理组（B，C）中有丝分裂的细胞数量。结果表明，紫杉醇以浓度依赖性方式增加了有丝分裂中的细胞数量（D）。结果清楚地表明紫杉醇作为微管解聚抑制剂的作用。

PrimeSurface为Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.的注册商标。
Olympus为注册商标，NoviSight和Insightful Analysis、Intelligent Answers均为Olympus Corporation的商标。