自动球差校正助力高分辨率、高对比度荧光成像

简介

荧光显微镜在生命科学和医学研究中广泛应用于细胞及其他生物样品的形态观察与定量分析。生物显微镜物镜通常基于标准盖玻片（厚度0.17毫米）与样品紧密接触的情形进行设计。

然而，在使用高数值孔径（NA）物镜时，微小差异——如盖玻片厚度变化或更深层样品定位——会引发球差，导致图像质量下降。多数高数值孔径物镜配备校正环（又称球差校正环），可根据盖玻片厚度校正球差。精细调节物镜校正环对实现出色 图像清晰度至关重要。

Evident的IXplore IX85倒置显微镜平台通过直观软件与电动校正环装置，实现了这一过程的自动化操作。[AS1] [RC2] 只需单击cellSens软件中的按钮，显微镜平台即可通过电动校正环控制机构自动调整多种高数值孔径物镜的校正环。这种自动物镜校正系统能有效减少球差，获得高分辨率、高对比度的清晰图像， 大大提升图像采集效率。

球差校正面临多重挑战

当盖玻片厚度偏离0.17毫米的标准设计值时，穿过物镜的中心光线与边缘光线无法汇聚于同一焦面，导致分辨率和对比度下降。这种现象称为球面像差，可通过调节校正环使光线焦面重合来进行修正（图2）。

该校正过程存在几个难点：首先需要同步微调校正环与焦面，以找到图像最清晰的位置。其次，确定合适校正点通常需要对比多幅图像来识别清晰度的细微提升。这一过程涉及旋转校正环、调整焦面、评估图像清晰度，并需反复操作以确定校正环的合适位置。显微镜操作人员必须具备专业经验才能完成如此精密的调整，这限制了不同实验中获得高质量再现的性能。

手动调节还耗时费力——在荧光成像中这一问题尤为突出，因为长时间曝光会导致样品出现光漂白现象。荧光成像中样品的信号水平可能原本就较低，因此通过快速准确的球差校正来保持高质量对比度，对于实现准确的观察与分析至关重要。

球差自动校正方法简介

图像清晰度可通过图像对比度的强度来表征。随着校正环角度和焦面位置的变化，最终形成的图像对比度会呈现倾斜的山形分布（图3a）。该分布曲线的峰值（图3b）对应球差的优化校正状态，而调节校正环实质上就是寻找这一峰值位置的过程。若校正不足导致偏离峰值（图3c），即使准确对焦，图像仍会模糊。

生成此类热图通常需在改变校正环与焦面的过程中采集多幅图像。这一过程不仅耗时，还会在荧光观察中导致样本光漂白，进而影响对比度值并导致观测精度下降。因此，自动球差校正必须兼顾速度与精度，以尽可能减少光漂白现象。

使用cellSens软件在IXplore IX85平台上新实现的荧光观察自动球面像差校正采用Nelder-Mead方法，可以有效地自动调整焦面位置和校正环角度。

对比度热图的梯度和扩散范围会随物镜的不同而呈现差异。然而，Nelder-Mead方法对优化目标函数的形状具有强适应性，即使函数呈非线性特征仍可有效应用。这一特性使其特别适合为各个物镜定义的热图进行调整。

该方法通过名为“单一形”的三点结构来实现最大对比度的搜索。首先，在初始三个点位获取对比度数值，如图4（1）所示。随后更新对比度最低点的位置，如 (2) 所示。重复更新一个或两个点位的过程，逐步缩小区间，当区间范围低于收敛标准时即终止搜索，如（3）至（10）所示。通过自适应方式缩小搜索范围，而非一次性全域扫描，这种方法可以有效地接近对比度最高的位置，而无需多余的搜索步骤。

与穷举搜索最大对比度相比，Nelder-Mead方法具有快速调整搜索的优点。在使用UPLXAP040X物镜和200毫秒相机曝光时间的测试条件下，Nelder-Mead方法大约需要20秒。相比之下，传统的穷举方法需要大约45秒才能找出对比度最高的位置。该方法需要更长的时间，因为它会将校正环角度θ分为10个部分，将Z分为10部分，综合覆盖100个点。 对比表明，新型自动校正方法将调整时间缩短了50%以上。

总结

IXplore IX85平台的电动校正环与自动校正算法，可实现手动难以企及的快速精准球差校正。自动球差校正功能还能通过快速精准的校正，尽可能减少荧光显微镜中的光漂白现象。该电动校正环与IX85系统一体集成，可通过cellSens软件实现轻松控制，并与Evident的各种标准物镜兼容。 这项创新使得不同技术水平的用户都能获得具备高分辨率与高对比度的清晰荧光图像。  

作者

Motohiro Shibata
微成像解决方案研发部，成像系统与技术处
Evident，日本