硅油浸没物镜在植物合子胚胎发生长期活细胞成像中的应用

植物合子胚胎发生

生命科学研究领域的胚胎发生研究与显微镜技术一起取得共同进步。特别地，有关动物胚胎发生的研究已经发展成对诸如胚胎发生干（ES）细胞的研究。与此相比，尽管已经很长时间，但植物胚胎发生的研究进展远不及动物胚胎发生的研究进展速度。进展缓慢的主要原因是被子植物的合子深深嵌入到母体组织的雌蕊中，因此难以实时观察受精卵细胞（合子）的分裂过程。
由Daisuke Kurihara博士领导的名古屋大学ERATO Higashiyama Live-Holonics项目光学技术小组一直致力于，通过使用活细胞成像和显微细胞操作技术来了解植物的生殖系统。最近，他们在世界上首次成功将植物合子的胚胎发生过程进行了活细胞成像。这在过去被认为是极为困难的。一系列研究成果于2015年7月发表在美国科学杂志Developmental Cell *上。在这项研究中，通过开发特殊培养基和新型微设备让植物合子分裂和生长的长期活细胞成像成为可能。
本应用指南介绍使用硅油浸没物镜对植物合子胚胎发生进行长期活细胞成像的示例，该物镜用于活细胞成像，并已在本研究中得到使用。

硅油浸没物镜的应用拟南芥合子胚胎发生的长期活细胞成像

１）长期实时观察活胚珠胚胎发生培养方法的确定

被子植物的胚胎发生发生在胚珠内，而胚珠深深地嵌入到雌蕊中（图1）。因此，不可能观察到活体合子分裂的胚胎发生。
由Daisuke Kurihara博士领导的名古屋大学ERATO Higashiyama Live-Holonics项目光学技术小组，通过使用拟南芥模型植物，并从雌蕊中去除胚珠，研究了在体外培养条件下，能够在胚珠中进行胚胎发生的培养基组成。通过检查支持正常胚胎发育和胚珠生长的培养基组成，当将海藻糖（一种有机物质）添加到子房的培养基中时，观察到胚珠存活频率和正常胚胎发育显著增加。这种新型胚珠培养基的开发让胚胎在雌蕊外的胚珠内发育成成熟种子，发芽，并从幼苗生长成成年植物（图2）。

图1.拟南芥花和胚胎发生的示意图
胚珠中的合子显著延长后，其以不对称方式分裂成较小的顶端细胞和较大的基底细胞。顶端细胞生成胚胎，最终成长为成年植物。

第7天	第10天	第14天	第19天
第26天	第32天	第37天

图2.在胚珠培养基中将早期胚胎培养生长为幼苗，再将让其生长为成年植物

接下来，Kurihara博士的研究小组致力于可实现稳定长期成像的微设备开发。由于胚珠为椭圆形的，因此其在观察过程中会移动并可能会晃动到显微镜视场外。因此，无法对几天内发生的胚胎发生过程进行稳定的实时观察。通过改进可以稳定保持胚珠的专有微笼阵列，他们开发出了微柱阵列。这是一种可以长时间稳定保持胚珠且不会阻止其生长的新型微设备。通过开发这种新型微设备和胚珠培养基，建立了用于将胚珠稳定长期稳定培养的新系统。

倾斜视图

俯视图

图3.使用微设备固定胚珠
均匀柱分布的微柱阵列可用于稳定长期保持胚珠。由于微柱固定胚珠但不阻止其生长，因此可以实现对胚胎发生进行深入的观察。比例尺为300 mm。

２）使用硅油浸没物镜对拟南芥合子胚胎发生进行长期活细胞成像

通过将上述胚珠培养系统和能够对胚珠内部被多层细胞覆盖的胚胎进行高灵敏度成像的显微镜系统相结合，实现了对胚胎发生合子到晚期胚胎的世界首次长期和实时观察。
本研究中使用的高灵敏度显微镜系统为采用30英寸硅油浸没物镜UPLSAPO30XS的全电动倒置显微镜IX系列。
硅油浸没物镜专门为活细胞成像而设计的，其光学设计基于接近活组织折射率（ne≈1.38）的硅油折射率（ne≈1.40）。该成像实验中使用的30英寸硅油浸没物镜UPLSAPO30XS具有1.05的高数值孔径和0.8 mm的长工作距离，这是在保持宽视野情况下进行深层高清成像的必备条件。与由于蒸发而需要补水的水浸物镜不同，由于硅油在运行数天的37°C温度条件下不会变干，该物镜不需要供应硅油。此外，硅油浸没物镜可与全电动研究型倒置显微镜IX系列的Z-漂移补偿系统IX-ZDC兼容使用。通过将硅油浸没物镜与Z漂移补偿系统IX-ZDC配合使用，可以获得实时聚焦的实时图像。
作为使用30英寸硅油浸没物镜UPLSAPO30XS进行活细胞成像的示例，从早期胚胎（4细胞阶段）到晚期胚胎（影片），可以进行67小时拟南芥胚发生过程的稳定实时观察。

图4.采用硅油浸没物镜的微设备成像示意图
使用电动XY载物台获取多点延时成像

影片。合子分裂和胚胎发生的活细胞成像
通过以10分钟间隔拍摄图像，记录了从早期胚胎（4细胞阶段）到晚期胚胎的胚胎发生过程，历时67小时。这部影片捕捉到前胚细胞形成圆形组织的同时，改变了分裂方向，并捕捉到只能横向分裂的悬浮细胞，形成杆状组织。数字表示从录制开始的时间。核和质膜分别标记为绿色（H2B-GFP）和品红色（tdTomato-LTI6b）。

成像条件
成像系统：全电动研究型倒置显微镜IX系列
物镜：硅油浸没物镜UPLSAPO30XS
共聚焦扫描振镜：CSU-X1（横河电机公司）
EMCCD相机：Evolve 512（Photometrics）
电动XY载物台：MD-XY30100T-Meta（Molecular Devices）
压电Z聚焦驱动器：P-721（Physik Instrumente）

在使用活细胞成像技术进行这项研究的同时，Kurihara博士的研究小组还开发了用于对整个植物进行光学透明化的新技术-ClearSee方法，并将其成果2015年10月发表在美国科学杂志Development上。
新开发的活细胞成像技术和新型植物光学透明化技术在全球范围的应用，有望为植物研究带来重大进展。
 

本应用指南在名古屋大学ERATO Higashiyama Live-Holonics项目光学技术小组组长Daisuke Kurihara博士的帮助下编写。

有关本应用指南所述研究的更多详细信息，请参阅以下文章。

*资料来源：Dev Cell.2015年7月27日； 34（2）：242-51。doi：10.1016/j.devcel.2015.06.008。Epub 2015年7月9日。
期刊：Developmental Cell
发表日期：2015年7月9日
标题：拟南芥早期胚胎发生的活细胞成像和光学操作Keita Gooh, Minako Ueda, Kana Aruga, Jongho Park, Hideyuki Arata, Tetsuya Higashiyama, 和Daisuke Kurihara

**资料来源: Development.2015年12月1日； 142（23）：4168-79。doi：10.1242/dev.127613。EPUB 2015年10月22日
期刊：Development
发表日期：2015年10月22日
标题：ClearSee：一种用于全植物荧光成像的快速光学透明化试剂Daisuke Kurihara, Yoko Mizuta, Yoshikatsu Sato, 和Tetsuya Higashiyama

硅油浸没物镜可实现长期深层高清3D活细胞成像

奥林巴斯拥有兼具高数值孔径和长工作距离的30/40/60/100´硅油浸没物镜（UPLSAPO30XS / UPLSAPO40XS / UPLSAPO60XS2 / UPLSAPO100XS）产品系列。由于硅油折射率（ne≈1.40）接近活组织的折射率（ne≈1.38），因此在观察厚活体组织时，折射率不匹配导致的球差减小，从而能够实现高分辨率成像。另外，由于硅油不会变干或变成固体，不需要额外添加浸没液体。硅油浸没物镜可与全电动研究型倒置显微镜IX系列的Z-漂移补偿系统IX-ZDC兼容使用。在实现始终稳定聚焦的长期、稳定高分辨率3D成像的同时，不受温度变化或试剂溶液添加的影响。