类器官能够模拟人体器官，在药物筛选和疾病建模中的作用变得日益不可或缺。 然而，由于它们的厚度和尺寸较大，给显微镜观测带来了特殊挑战。
研究人员一般交替使用低倍率物镜进行导航和高倍率物镜观察细节的方法，或者采用图像拼接技术采集整个样本。 虽然标准干式物镜使用方便，但在对类器官脑进行深层成像时的分辨率和工作距离往往无法满足需求。
为实现高分辨率 3D 成像，共聚焦显微镜配合浸液物镜（水、油或硅油）是公认的金标方案。 但这种方法在操作有一定挑战性： 在载物台移动过程中，油与样本的接触可能会脱离，而培养皿底部残留的油渍在切换回干式物镜时会降低图像质量。
本贴文中我们将评估一项突破性的解决方案： 首款硅凝胶物镜（LUPLAPO25XS) 配合 FLUOVIEW™ FV5000激光扫描共聚焦显微镜用于脑类器官成像。 我们探讨这项光学技术与传统硅油物镜相比的三个主要优势。
类器官成像实验方案
为评估硅凝胶物镜的优势，我们采用了以下方案生成的类器官：
脑类器官生成
人诱导多能干细胞（hiPSCs；201B7 系）在 eTeSR 培养基（STEMCELL Technologies）下保持未分化状态。 脑类器官使用 STEMdiff 脑类器官试剂盒（STEMCELL Technologies）生成。 分化过程（包括胚状体形成、神经外胚层诱导和随后的类器官成熟）均按照 STEMdiff 脑类器官试剂盒提供的说明进行。
免疫染色和组织透明化
类器官固定并进行免疫染色，使用 DAPI 进行核标记，使用抗 TUJ1（Alexa Fluor 488）进行神经元标记，使用抗 PAX6（Alexa Fluor 594）进行神经祖细胞标记。 染色后，在成像前使用 ScaleS4 组织透明化试剂对样品进行透明化处理。
使用硅凝胶物镜进行脑类器官成像的3个优势
实验表明，LUPLAPO25XS 硅凝胶物镜与 FV5000 共聚焦显微镜配合使用，能够有效地解决脑类器官成像中常见的操作难题。 以下为三个主要优势：
1. Z轴稳定性：避免发生浸液脱离
传统的硅油物镜需要在镜头和培养皿底之间形成连续的液桥。 在进行深度Z-stack 成像或大幅度 Z 轴对焦调整时，液桥很容易断裂。
- 硅油带来的挑战 一旦硅油与物镜脱离，当返回原始的 Z 坐标时通常会导致图像模糊，因为硅油不会自动重新形成完美的弯月面。 研究人员必须进行手动调整，重新添加硅油或调整物镜，从而导致实验中断（图1）。
- 硅凝胶的优势 由于硅凝胶具有弹性，因而接触更加稳固。 即使物镜离开培养皿，只要返回目标Z坐标，也能瞬间恢复高分辨率图像。 因而调焦更灵活，成像的可重现性更高（图 2）。
图 1. 硅油与物镜脱离后会导致图像亮度和质量下降。 蓝色： 核。 绿色： TUJ1。 红色： PAX6。
左图： 使用 UPLSAPO30XSIR 硅油物镜的常规观察；图像非常清晰。
右图： 使用移开功能移走物镜后再重新定位物镜时，由于物镜与样品之间缺少浸油，图像亮度和质量会下降。
图 2. 即使移走物镜，硅凝胶仍然保持接触。 蓝色： 核，绿色： TUJ1，红色： PAX6。
左图： 使用 LUPLAPO25XS 硅凝胶物镜进行常规观察时，图像非常清晰。
右图： 使用移开功能移走物镜后再重新定位物镜时，图像质量仍然保持不变。
2. 无缝物镜切换： 零清洁的工作流程
在常规观察操作中，研究人员经常需要在进行高分辨率观察后切换回低放大倍率的干式物镜。
- 硅油带来的挑战： 硅油会在培养皿底部留下难以清理的残留。如果在没有彻底清洁培养皿的情况下切换到干式物镜，残留的硅油会导致严重的球差，影响图像效果。 该清洁过程耗时较长，并有扰动样品的风险（见图 3）。
- 硅凝胶的优势： 硅凝胶不会流动，也不会在培养皿上留下残留浸液。验证表明，从硅凝胶物镜切换到干式物镜后，可以立即继续进行观察，图像质量不会有任何下降。 此过程实现了无缝切换，既具有干式物镜的便利性，也可以获得浸液成像的光学性能（见图 4）。
图 3. 使用硅油物镜前后的干式物镜的图像对比 灰色： 核。
左侧： 使用硅油物镜前20X 干式物镜的图像（UPLXAPO20X）。
右图： 使用硅油物镜后20X 干式物镜的图像。 由于样品上有浸油残留，图像质量下降。
图 4. 使用硅凝胶物镜前后的干式物镜的图像对比。 灰色： 细胞核。
左侧： 使用硅凝胶物镜前20X干式物镜的图像（UPLXAPO20X）。
右图： 使用硅凝胶物镜后20X干式物镜的图像。由于干式物镜和样品之间没有残留浸液，因此图像质量保持不变。
自动化多孔板成像的成功：图像拼接的稳定性
高通量研究常常需要在多孔板中的多个类器官之间进行图像拼接和3D成像。
- 硅油带来的挑战： 在孔中间移动载物台时，通常会使得硅油脱离甚至耗尽，从而导致自动成像失败。 在我们的测试中，硅油物镜在离开第一个孔后，无法维持成像效果（图 5）。
- 硅凝胶的优势： 硅凝胶物镜成功采集到多个孔中所有的目标类器官，未发生任何介质脱离的问题（图 6）。
图 5. 使用硅油物镜进行多位置成像（6×6 拼接图像）。 蓝色： 核。 绿色： TUJ1。 红色： PAX6。 使用硅油物镜观察三个不同的类器官。 由于失去与硅油的接触，从第二个类器官开始便成像失败。而腔室载玻片的每个孔中都有类器官标本。
图 6. 使用硅凝胶物镜进行多位置成像（6×6 拼接图像） 蓝色： 核。 绿色： TUJ1。 红色： PAX6。 使用硅凝胶物镜观察了三种不同的类器官，成功对所有类器官进行了高质量成像。 腔室载玻片的每个孔中都有类器官标本。
类器官研究的新标准
经过验证， LUPLAPO25XS 硅凝胶物镜 具有以下两大优势：干式物镜的易用性和浸液物镜的光学性能
当与FV5000共聚焦激光扫描显微镜结合使用时，这项光学技术可有效解决类器官成像的诸多挑战，包括反复接触造成浸油缺失、不同观察方法之间的清洁步骤以及自动成像运行的意外中断。
结果： 研究人员可以将更多精力集中在实验上，而不是物镜上。
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