激光扫描显微镜简介

激光扫描显微镜使用激光照明，通过逐点扫描来生成样品的高分辨率、高对比度3D图像。两种常见的激光扫描显微镜包括共聚焦激光扫描显微镜和多光子激光扫描显微镜。虽然两者均使用激光激发样品，但它们之间存在一些关键区别。接下来，我们将解释共聚焦激光扫描显微镜和多光子激光扫描显微镜的工作原理、用途以及它们可以创建的图像类型。

共聚焦激光扫描显微镜的原理

多光子激光扫描显微镜的原理

多光子激光扫描显微镜的工作方式与共聚焦激光扫描显微镜非常相似。但共聚焦激光扫描显微镜使用的是波长较短的可见激光来激发样品，而多光子激光扫描显微镜使用的是飞秒红外（IR）脉冲激光，其发射波长是单光子激发所需波长的两倍。当样品中的染料同时吸收两个光子时，即可发出荧光。这种双光子吸收现象仅发生在光子密度高度集中的焦点位置，并且只有焦点处的染料可以激发并发射荧光。因此，多光子激光扫描显微镜系统不需要通过针孔孔径来阻挡其非退扫描探测器（NDD）的离焦荧光，并且可以有效地检测来自焦点的荧光。采用替代激发方法的原因是，波长较长的激光可以深入组织，使对活体组织实体数百微米深的观察和成像成为可能。此外，与短波可见激光相比，光毒性降低。因此，多光子激光扫描显微镜更适合用于活体动物体内活细胞和组织的研究。

激光扫描显微镜用途

尽管共聚焦激光扫描显微镜最常用于生物学研究，但其在许多领域都能发挥用处。该类型显微镜通常用于细胞生物学研究、癌症研究和干细胞研究，因为共聚焦激光扫描显微镜能够创建非常详细的细胞3D图像，使观察人员能够观察其扫描的样品的内部。这得益于共聚焦激光扫描显微镜可利用光进行光学切片，以生成厚组织样品的高分辨率图像，而无需对样品进行物理切片。由于飞秒红外脉冲激光的深度穿透，多光子激光扫描显微镜最适合活体动物成像。因此，该类型显微镜经常用于神经科学研究和癌症研究。

激光扫描显微镜的优缺点

激光扫描显微镜已成为细胞和生物组织研究不可或缺的一部分，这在很大程度上归功于其对样品的逐点扫描能力。共聚焦激光扫描显微镜还具有其他优势，包括能够创建细胞和组织的高分辨率、高对比度3D图像，而无需对样品进行物理切片。

激光扫描显微镜之所以能够产生如此高质量的图像，是因为它们能够有效地通过共聚焦针孔抑制离焦荧光，从而使探测器一次只能采集一个聚焦的点。

正因为如此，采集样品的完整3D图像可能需要很长时间。但可用设备的进一步发展加快了这一过程。与传统的振镜扫描相比，共振扫描可以提供高达每秒30帧的更高速度成像，以观察细胞内的血流或离子流等快速动态事件。

激光扫描与转盘

技术上的进步加速了激光扫描显微镜的逐点收集能力，旋转圆盘的引入就是一个例子。转盘共聚焦显微镜与用于阻挡离焦荧光的针孔数量有关。虽然共聚焦激光扫描显微镜使用单个针孔，但转盘共聚焦显微镜使用的是拥有数百个针孔并可以高速旋转的不透明圆盘。因此一次扫描即可对整个样品进行成像，而不是逐点成像。这也有助于减少光损伤和光漂白。

激光扫描显微镜图像

如前所述，共聚焦激光扫描显微镜图像的高分辨率和对比度是由于其阻挡了离焦荧光通过针孔到达探测器。在创建3D图像后，观察人员可以在某些情况下操纵甚至探索图像内部。

激光扫描显微镜与扫描电子显微镜

虽然名称相似，但激光扫描显微镜和扫描电子显微镜的主要区别在于样品的照明方法。激光扫描显微镜使用激发激光，而扫描电子显微镜，顾名思义，使用电子束照射样品。来自样品表面的反射电子或二次电子会产生关于其形貌或成分的信号，并经由探测器收集。由于样品必须处于真空状态，所以扫描电子显微镜不能用于观察活体样品。

激光扫描显微镜放大倍率

激光扫描显微镜可与各种不同倍率的物镜配套使用。因此，激光扫描显微镜的最大倍率取决于所使用的物镜。低倍率物镜非常适合捕捉整个组织样品的结构。如果需要捕捉构成组织的细胞的形态，中等倍率的物镜就足够了。而高倍率物镜可用于查看构成组织的细胞内的微观结构。