渐变对比度方法简介

1. 简介

自16世纪发明光学显微镜以来，光学显微镜为生物学研究（包括微生物和红细胞的发现）作出了巨大贡献。在19世纪，样品染色技术得到了发展，透明结构可以用彩色造影剂染色，使其更容易被看到。遗憾的是，染色具有毒性，这限制了其在活体标本中的使用。从20世纪开始，各种观察非染色透明物体的方法，如相衬显微镜，应运而生，至今已成为生物学研究领域中不可或缺的工具。

2. 相衬方法的变化

图1通过相应的光学元件排列简要说明了无需染色即可观察透明物体的常见相位可视化方法。传统的相位可视化方法通过在聚光镜瞳孔和物镜瞳孔中分别放置特定光学元件来实现。

相衬方法（图1a）组合使用带环状孔径的专用聚光器透镜和含有相位膜环的专用物镜透镜。在通过聚光镜环状孔径的光线中，那些直接通过样品的光线会通过物镜瞳孔的相位膜。另一方面，被样品偏转的光线在相位膜外通过，从而在两个分量相互干扰的点产生明暗对比。这一过程的典型特征是，在样品的折射率分布发生变化的台阶处会出现叫做光晕的光斑。厚的样品不适合采用这种方法，因为会出现过强的光晕。

微分干涉方法（图1b）是一种偏振剪切干涉仪，在聚光镜瞳孔和物镜瞳孔位置装有互补的沃拉斯顿棱镜。样品图像变为在固定方向上略微偏移的重像，并且样品的折射率台阶带有阴影，使其看起来具有三维立体感。由于采用了偏光干涉，如果有塑料皮氏培养皿或其他物体在光路中造成偏振失真，则无法进行观察。

调制对比方法（图1c）利用聚光镜瞳孔的狭缝开口将照明光束限制在一个方向。引导光束会使样品中光的直线部分呈现灰色，而由于物镜瞳孔的调制器，折射部分的对比度将根据折射方向而变化。通过透射或屏蔽部分光，可以获得类似于微分干涉图像的三维图像。由于调制对比方法中不使用偏光，可以使用皮氏培养皿之类的塑料容器。但使用这种方法时分辨率略有下降，因为限制照明光束的方向意味着照明数值孔径（NA）较小。

图1. 各种相位可视化方法的光路布置

各种相位可视化方法的必要光学元件。a.相衬方法；b.微分干涉方法；c.调制对比方法；d.渐变对比方法。

3. 渐变对比方法

渐变对比方法（图1d）的特点是生成一个类似于微分干涉方法图像的伪三维图像。其他相位可视化方法需要使用多个光学元件在未染色样品中产生对比，而渐变对比只需在物镜瞳孔中插入一个渐变ND滤光片即可实现。

渐变对比方法的原理

插入到物镜瞳孔位置的渐变ND滤光片在一个方向上的透射率单调递减。与物镜瞳孔直径相比，投射在物镜瞳孔位置的聚光镜透镜的孔径直径有所减少。如果样品的折射率分布平坦，聚光镜透镜的孔径图像会投射在物镜瞳孔的中心位置，并随后受到渐变ND滤光片中心附近透射率的影响（图2a）。当样品的折射率分布发生倾斜时，聚光镜透镜的孔径图像会从渐变ND滤光片的中心偏移，因此当光束在样品位置发生折射时，渐变ND滤光片的整体透射率会发生变化（图2b和c）。因此，它的成像亮度与样品折射率的倾斜度相对应，并且样品的折射率分布呈现三维立体状（图2d）。

聚光镜透镜的孔径可以用孔径光阑进行调整。如果它相对较大，则由于样品的折射率倾斜而引起的亮度变化可能不足。因此，使用图像传感器捕获的图像会被强调并以易于查看的对比度显示。

图2. 渐变对比方法原理的示意图

用渐变对比方法说明相位物体的明暗对比原理。a. 如果样品的相位分布平坦，光束会直射并笔直地通过渐变ND滤光片的中心附近。b、c.如果样品的相位分布倾斜，则光线会发生折射，使倾斜方向通过渐变ND滤光片(b)的较亮部分或(c)较暗部分。d. 观测图像的明暗对比取决于样品相位分布的倾斜方向。

渐变对比方法的特性

渐变对比方法产生的相位图像具有以传统相位可视化方法产生的图像所不具备的许多优点。可对厚样品采用渐变对比方法，因为与相衬方法不同，该方法不会产生光晕。与微分干涉方法不同的是，渐变对比方法不基于偏振，因此即使透过塑料容器，也可以很好地生成样品的伪三维图像。此外，由于其照明的数值孔径大于其他方法，因此不易出现因透过有水滴的皮氏培养皿盖成像而产生的问题。该特性还可防止在调制对比方法中采用屏蔽元件而导致的分辨率下降。另一个实用优点是，无需专用物镜，也无需在物镜转换时切换元件，从而可以更快、更方便地进行观察。

渐变对比方法的光学配置

APX100成像系统的光学配置如图3所示。光通过光路照射到样品上并在成像面上成像。

渐变ND滤光片放置在与物镜的瞳孔位置共轭的位置。该滤光片仅在系统设置为采用渐变对比方法时才会进入光路。聚光镜的开口直径会根据物镜的放大倍率和瞳孔直径自动调整到最佳值。

图3. APEXVIEW APX100台式荧光显微镜的光学配置，用于对未染色样品进行渐变对比观察

渐变对比应用

下面，用10倍物镜观察容器1和容器2中的海拉细胞，并使用前面阐述的四种观察方法捕获图像，以便对图像进行比较。

1. 玻璃底盘 ※ 上面盖有塑料盖
2. 12孔多孔板 ※水滴附着在上面的塑料盖上

结果的比较：

1. 渐变对比图像与相衬和调制对比图像相当。在微分干涉图像中，塑料盖会降低偏光性能，因此对比度较低。
2. 与其他观察方法相比，渐变对比图像具有更均匀的视场和很好的对比度。其照明的数值孔径大于其他观察方法，且受样品上异物和容器内水滴的影响较小。

4. 总结

渐变对比方法是一种相位物体观察方法，使用简单的光学配置，只需在物镜瞳孔中添加一个渐变ND滤光片即可。它非常适合观察透明的、没有染色的活体样品。相比传统相位物体观察方法，渐变对比方法的优势包括：

• 非常适合厚样品
• 可有效观察塑料皮氏培养皿中的样品
• 可透过皮氏培养皿的盖子进行观察，从而可降低污染培养细胞的风险
• 不需要专用物镜
• 不需要在转换物镜时切换元件

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