渐变对比度方法简介

1.简介

自16世纪发明光学显微镜以来，光学显微镜为生物研究（包括微生物和红细胞的发现）作出了巨大贡献。在19世纪，标本染色技术得到了发展，透明结构可以用彩色造影剂染色，使其更容易被看到。遗憾的是，染色有毒，这限制了它在活体标本中的使用。从20世纪开始，各种各样查看非染色透明物体的方法—如相差显微镜—被开发出来，成为生物研究领域至今不可或缺的工具。

2.相衬方法的变种

图1通过相应的光学元件排列简要说明了用于无染色查看透明物体的常见相位查看方法。传统的相位查看方法通过在聚光镜瞳孔和物镜瞳孔中分别放置特定光学元件来实现。

相衬方法（图1a）组合使用带环状孔径的专用聚光器透镜和含有相位膜环的专用物镜透镜。在通过聚光镜环状孔径的光线中，那些直接通过标本的光线会通过物镜瞳孔的相位膜。另一方面，被标本偏转的光线在相位膜外通过，从而在两个分量相互干扰的点产生明暗对比。这一过程的典型特征是，在标本的折射率分布情况发生阶梯式变化的部位会出现叫做光晕的光斑。厚的标本不适合采用这种方法，因为出现的光晕过强。

微分干涉方法（图1b）是一个偏振光错位干涉仪，在聚光镜瞳孔和物镜瞳孔位置具有互补的沃拉斯顿棱镜。标本图像变为在固定方向上略微偏移的重像，并且标本的折射率阶梯带有阴影，使其呈现为三维形式。由于采用了偏光干涉，如果有塑料皮氏培养皿或其他物体在光路中造成偏振失真，则无法进行观察。

调制对比方法（图1c）利用聚光镜瞳孔的狭缝开口将照明光束限制在一个方向。引导光束会使标本中光的直线部分呈现灰色，而由于物镜瞳孔的调制器，折射部分的对比度将根据折射方向而变化。通过发送或屏蔽一部分光，可以获得类似于微分干涉方法的三维图像。由于调制对比方法中不使用偏光，可以使用皮氏培养皿之类的塑料容器。但使用这种方法时分辨率略有下降，因为限制照明光束的方向意味着照明数值孔径(NA)较小。

图 1.各种各样相位查看方法的光路布置

各种各样相位查看方法的必要光学元件。a.相衬方法；b.微分干涉对比方法；c.调制对比方法；d.渐变对比度方法。

3.渐变反差方法

渐变反差方法（图1d）的特点是生成一个类似于微分干涉对比方法的伪三维图像。其他相位查看方法需要使用多个光学元件在未染色标本中产生对比度，而渐变反差方法可以通过简单地将渐变ND滤光片插入物镜瞳孔来实现。

渐变反差方法的原理

插入物镜瞳孔位置的渐变ND滤光片在一个方向上具有单调递减的透射率。与物镜瞳孔直径相比，投射在物镜瞳孔位置的聚光镜透镜的孔径直径有所减少。如果样品的折射率分布平坦，聚光镜透镜的孔径图像投射在物镜瞳孔的中心位置，并随后受到渐变ND滤光片中心附近透射率的影响（图2a）。当样品的折射率分布发生倾斜时，聚光镜透镜的孔径图像会从渐变ND滤光片的中心偏移，因此当光束在样品位置发生折射时，渐变ND滤光片的整体透射率会发生变化（图2b和c）。因此，它的成像亮度与样品折射率的倾斜度相对应，并且样品的折射率分布呈现三维状（图2d）。

聚光镜透镜的孔径可以用孔径光阑进行调整。如果它相对较大，则由于样品的折射率倾斜而引起的亮度变化可能不足。因此，使用图像传感器捕获的图像会被强调并以易于查看的对比度显示。

图 2.渐变反差方法原理的示意图

用渐变反差方法对相位物体上明暗对比原理的说明。a.如果样品的相位分布平坦，光束笔直地通过倾斜ND滤光片的中心附近。b、c.如果样品的相位分布倾斜，则光线会发生折射，从而使倾斜方向通过倾斜ND滤光片(b)的较亮部分或(c)通过较暗部分。d.根据标本的相位分布倾斜方向，以明暗对比来查看所需观察的图像。

渐变反差方法特性

渐变反差方法产生的相位图像具有传统相位查看方法所不具备的许多优点。可对厚标本采用渐变反差方法，因为与相衬方法不同，该方法不会产生光晕。由于渐变反差方法与微分干涉方法不同，并非基于偏振，因此即使通过塑料容器也可以生成满意的标本伪三维图像。此外，由于照明光束的NA大于其他方法，因此不太容易受到通过有水滴的皮氏培养皿盖成像所引起问题的影响。该特性还可防止由于在调制对比方法中采用屏蔽元件而导致的分辨率下降。另一个实用优点是，在物镜转换时不需要专用物镜或开关元件，从而提高了观察的速度和简易性。

渐变反差方法的光学配置

APX100成像系统的光学配置如图3所示。光通过光路照射到标本上并在成像面上成像。

渐变ND滤光片放置在与物镜的瞳孔位置共轭的位置。该滤光片仅在系统设置为采用渐变对比度方法时才会进入光路。聚光镜的开口直径会根据物镜的放大倍率和瞳孔直径自动调整到最佳值。

图 3.适用于对未染色样品进行渐变对比度观察的APX100光学配置

应用

在下方，用10倍物镜观察了容器1和2中的海拉细胞，并使用前面阐述的四种观察方法采集了图像，以便可以比较图像。

1. 玻璃底盘 ※ 盖有塑料顶盖
2. 12孔多孔板 ※水滴附着在顶部的塑料盖上

结果的比较：

1. 渐变反差图像与相位对比和调制对比图像相当。在微分干涉对比图像中，盖有塑料盖时偏光性能下降，因此对比度较低。
2. 与其他观察方法相比，渐变对比度图像具有更均匀的视场和合格的对比度。光照的NA大于其他观察方法，并且受标本上异物和容器内水滴的影响较小。

4.摘要

渐变反差方法是一种采用简单光学配置的相位物体观察方法，只需要在物镜瞳孔上添加一个渐变ND滤光片，它非常适合用于不染色观察透明的活体标本。渐变反差方法相比传统相位物体观察方法的优势包括：

• 它非常适合厚标本
• 它对塑料皮氏培养皿中的标本有效
• 可以通过皮氏培养皿的盖进行观察，从而降低污染培养细胞的风险
• 不需要专用物镜
• 不需要在转换物镜时切换元件

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