多模态成像和多靶点荧光标记已成为实验中检测样品不同组分必不可少且行之有效的方法。最终实验的定量结果只取决于您从大量图像数据中提取信息的能力。
全玻片成像在量化实验中的重要性
全玻片成像的基本原理是将视野较小的高倍率图像以数字化方式拼接成更大的样品全貌。为什么要全玻片成像？
简而言之，全玻片成像（也称为数字切片成像或虚拟显微镜）目的是为显微图像提供更完整的生物学信息。在高倍率下单独观察一两个细胞也许很有意义，但是将其放在整个组织的较大范围内则可提供更广阔的研究角度。
那为什么不只拍摄组织的宏观图像呢？全玻片成像的强大之处在于从宏观到微观的观察，无论在完整组织内对细胞核计数，还是在脑环路追踪轴突，都能提供更多量化信息。
得益于微观分辨率与宏观成像的强大组合，自动全玻片成像已经成为众多科研项目的得力助手。继续阅读以了解其从样品中提取新信息的强大能力。
自动全玻片扫描系统的成像功能
多年来，全玻片成像系统的成像模式一直受限。如今，诸如我们的VS200研究级全玻片扫描系统这样的自动全玻片成像系统可以融合多种观察方法，让您能够观察只在特定条件下才可见的结构。这也就意味着您可以交叉使用以下多种观察方法：
- 明场：在明场成像中，透射光穿过样品，通过染料实现组织可视化。但如果不使用苏木精和曙红等染料，明场成像并不具备成像对比度。
- 荧光：实现特异性抗体标记和分子靶向。还可以进行多靶点标记，实现多重荧光成像。
- 相衬和偏光：可以利用相差环板和偏光照明等不同的光路设置，检测标本天然的信号对比度。
- 暗场：利用组织中膜结构的折射率差异成像。虽然可以用特定染色增强暗场效果，但暗场成像可以实现无标记，并具备与荧光相当的对比度。但这种观察方式对灰尘比较敏感。
睾丸切片，未染色，20X物镜拍摄。明场（左上），荧光（右上），暗场（左下），偏光（右下）。图片数据由德国Günthersleben的Robin Wacker提供。
但这还不是全部——最新的全自动玻片扫描系统搭配特定成像工具可帮助您从实验中提取更佳的数据。例如，我们的VS200全玻片扫描系统可以聚焦多个组织平面，得以：
- 以最高分辨率采集多层图像
- 检测标本厚度可达100 µm
- 可使用所有观察方法采图
- 轻松获取样品多个维度信息
- 计算投影（反卷积、Z轴最大亮度投影或景深扩展EFI）
Z-stack能够以最高分辨率捕捉多达35个平面，从而轻松获取标本所有维度信息。
另一个有用工具是自动加油系统，它与油镜配合可以实现最高的成像分辨率采集。
这些成像模式与特异性抗体标记技术一起使用，功能将会更加强大。然而，荧光标记仍然难以有效定量。
考虑到这一点，我们下一部分将介绍有助于实现多靶点荧光应用的成像技术。
组织多靶点荧光的技术要点
由于肿瘤微环境极其复杂，荧光多靶点标记已成为免疫肿瘤学研究的有用工具，借助专门的软件和设备即能开启感兴趣的肿瘤观察。
目前各个厂商也已经开发出了能够应对不同需求并能在大范围推广的全新技术方案。这些技术必备条件包括：
高端荧光多重标记：
| 工作流程可实现：
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全玻片成像可记录：
| 可以识别复杂表型的软件：
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UltiMapper™多靶点荧光标记分析概述
多靶点荧光标记成像实验的另一项有帮助的技术就是UltiMapper I/O分析。
UltiMapper I/O分析采用InSituPlex®技术，让高分辨率多靶点全景检测能用于生物标志物活动的细胞表型和空间分布。这个解决方案提供的试剂盒可无缝整合到整个免疫组织化学（IHC）工作流程所涉及的设备和软件中，让研究人员能够在一天之内完成从标本染色到图像采集和数据评估。
下图是简单的四步过程：
第1步：修复：
- 按通用步骤脱蜡并修复样品
第2步：染色
- 每轮染色将样品与DNA条形码抗体的混合物一起培养
- 每种抗体均具有独特的DNA序列（条形码）
第3步：信号放大
- 同步放大所有靶标
- 增加每种抗体的DNA条形码比例，允许更多互补的探针链结合
第4步：检测
- 添加互补的荧光DNA探针用于结合靶标
- 样品准备进行成像
- DNA杂交技术
影响量化成像质量的3个因素
在设计实验时，请务必记住光学平台与染色技术的匹配将会带来最佳的下游数据分析。使用较差的试剂或不合适光学配置致使图像质量下降，进而无法做出好的数据分析。
以下是影响量化成像质量的3个光学因素：
- 准确的照明色温：在H＆E染色中获得真实的色彩还原非常重要。透射光源应具有仿卤素光源的光谱特性才能再现紫色、青色和粉红色。
VS200系统用于透射光照明的真彩色LED具有与卤素灯相同的光谱特性和功率，因此可以对紫色，青色和粉红色的染色进行准确展现、成像和渲染。
- 色彩保真度和精度：除了具备正确的照明光谱特性外，显微镜相机还应具备出色的色彩保真度和精度。确保使用具备色彩校正平衡的相机才能准确地还原组织信号。由于不同的采集设置会取得不同的图像结果，目测数字图像可能比较主观，但是色彩校正相机和ICC配置文件可在计算机显示器上重现出非常出色的色彩和强度。
由于不同的采集设置会获得不同的图像结果，目测数字图像可能比较主观。VS200全玻片扫描系统使用色彩校正相机并提供ICC配置文件，可在计算机显示器上展现出非常出色的色彩和强度。
- 视场平场性：在视场不平坦或没有内置校正的情况下采集的系列图像会在每个视场中出现光晕效果，这将导致量化出现问题。在这种情况下，必须花时间和精力对每个视场进行校准和处理。因此，采用有助于最大限度提高平场性的光学部件，将能取得更好的定量结果。
VS200研究级全玻片扫描系统配置的高性能X Line™物镜能大幅度提高图像的平场性。
最后一点思考
由于可以使用多焦点Z-stack采集三维图像，您可以进一步使用诸如反卷积、最大强度投影或景深拓展等方法改善图像之类，并为图像选择最佳焦平面。
总而言之，定量分析解决方案是需要良好标记、优质光学和多功能软件综合方案，这样的结合才能确保有效分割分析数据，进而获取生物学相关的统计信息。
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