共焦显微镜物镜

对于任何传统的光学显微镜配置，物镜是系统中决定图像信息内容的关键部件。有关标本细节的对比度和分辨率、从标本中所获信息的深度以及像场的横向范围图像的边缘部分都由物镜的设计及其在特定观察条件下的性能决定。在扫描共焦技术中，对物镜提出了额外的要求，其中，这一关键的成像部件还用作照明聚光镜，而且通常需要在宽波长范围和昏暗光线下执行高精度作业，避免引入任何不可接受的导致图像质量下降的噪点。

无论任何其他系统部件的功能如何，无法在图像中添加最初未被物镜捕获的信息。成像路径中的某些中间部件可以执行校正功能，但它们的主要性能要求是尽可能降低对于从物镜接收的基本图像信息的负面影响。传统上，为特定应用选择物镜时，考虑的主要变量是放大倍率、是否需要采取干式或浸式设计，以及透镜系统的数值孔径。由于激光、荧光染色素和全新标本标记能力方面的技术进步，以及显微镜制造商持续不断地改进光学器件，新成像技术的发展很大促进了某些研究领域的进步。细胞和分子生物学以及神经科学领域尤其如此，共焦显微镜与荧光技术相结合已成为广泛依赖的研究工具。

图1所示是一种高性能物镜，专门设计用于从紫外到近红外光谱区域的激光照明。该物镜是一款60X平场（平面）复消色差油浸型号物镜，其波长范围为405至1000纳米。该物镜适合的应用包括同时进行荧光和微分干涉对比（DIC）观察。

共焦仪器显微镜对物镜的一般要求与其他关键临界照明显微镜应用相似，尽管随着新技术的发展，对于物镜的要求在不断地扩展，这也使得这些物镜普遍更接近于此类透镜系统的性能极限。某些应用的特定限制表明，与传统上认为的重要的特征相比，一些其他物镜特征可能也同样重要，或更为重要。为了满足目前颇具发展前景的技术的基本要求，制造商推出了一些新型的光学器件，以期优化相关方法的性能。高数值孔径、高度校正的硅油浸入式物镜的研发是应为了满足活体细胞和组织研究急剧增加的需要，这些研究必须在水介质中进行。光学器件的发展可能一定程度上受共焦显微镜应用特定要求的影响，这些光学器件的设计初衷并非严格校正一个或多个影响分辨率的像差，而是为了实现对共焦性能更为关键的其他设计目标。

激光扫描显微镜的分辨率

光学系统中的分辨率通常被认为是两个标本特征之间的最小分离距离，可在最终图像中将两者区分开来。根据视觉识别所需的特定对比度定义，分辨率可以量化为光波长（λ）和光学系统数值孔径（NA）的函数。在理想的衍射受限极限系统中，衍射波在通过透镜孔径时会发生干涉，的衍射波前之间的干涉会在导致图像平面中产生艾里圆盘的强度分布艾里斑的疏密条纹，其直径（d）的方程如下所示：

d_Airy= 1.22 • λ/NA

著名的瑞利判据认为，当两个相同点之间的间隔为艾里圆盘斑直径的一半时，则几乎无法辨别。因此，艾里斑半径（r）相当于横向分辨率，可通过修改前述公式对其进行定义。使用落射荧光时，物镜既是聚光镜，也是物镜，因此在以下表达式中，NA代表物镜数值孔径：

r_Airy= 1.22 • λ/(2 • NA)

衍射限制极限导致强度从点光源亮度物体横向重新分布，到形成艾里斑图案中，还会沿着光轴产生散焦，从而改变图像点的大小和形状。三维强度点强度扩散函数描述了强度光强分布，代表光学系统将标本信息传输到图像平面的性能。存在大量光学像差是折射透镜系统的特征，任何未经物镜设计校正或未经另一光学元件补偿的像差都将改变代表图像中每个标本点的强度分布，相对于基于理想的衍射受限极限性能，将导致图像质量降级。为相关技术选择物镜时，必须考虑共焦应用中潜在像差的相对重要性。物镜设计和性能的主要因素，特别是与共焦显微镜有关的因素，将在下文的相关章节中讨论。

在生物应用中，使用广泛的共焦显微镜配置是通过计算机控制的扫描系统使照明激光束发生偏转，并穿过物镜聚焦于静止的标本上。这被称为轴外共焦扫描，因为扫描光束被偏转到光轴的每一侧并利用了物镜元件的外围区域。一些早期通过光学显微镜执行运行的扫描技术采用的是轴上扫描，其中激光束仍然固定在光轴上，并对标本台或物镜进行扫描。

虽然原则上这两种扫描方法可以产生类似的结果，但是对于轴上和轴外照明扫描，选择合适性能的物镜时所应遵循的要求明显不同，在收集所发出的穿过物镜的荧光时所应考虑的事项也不同。第三种扫描仪可利用旋转的Nipkow盘来扫描标本上的众多照明点，无需移动光源或显微镜载物台。Nipkow系统在活细胞研究中很受欢迎，因为与使用高强度扫描激光源的配置显微镜相比，其能够将细胞损伤降至最低。

影响物镜性能的透镜像差可分为两类，包括非色差（不随波长变化）和色差，其与波长有关。色差根据其特点包括横向色差和纵向色差，与波长无关的组类型包括球面像差、彗差、像散、场曲率和失真。色差和球面像差会影响整个像场，而其余的像差则在轴外区更普遍。色差和球面像差（见图2）最容易对共焦性能产生负面影响。一般来说，色差不能在程序上进行修改，必须通过光学元件的设计来处理。其他伪影，特别是球面像差，通常会因物镜的不当使用或引入了不匹配的光学元件而加剧，但可以通过遵循适当的方法或对光学系统的调整尽可能减少此类伪影或进行补偿。

球面像差

球面像差是对共焦性能最重要的非色差，它是球面透镜部件特性的一种表现，导致旁轴和周边光线聚焦于连续平面。穿过不同透镜区的光线路径的不同折射度会导致标本点源的聚焦图像模糊，并在焦平面上方和下方产生不对称的强度变化。在所有现代物镜中，如果物镜设计的指定操作变量完全满足，则球面像差可校正到视觉上无法察觉的水平。遗憾的是，实践中存在着多种可能性，从而允许偏离物镜的光学设计标准，并导致球面像差。由于球面像差只能针对物镜与标本和图像平面之间准确指定的距离关系进行适当校正，因此，如果物镜没有保持指定的物镜镜筒长度，则可能会无意中引入伪影。如果将物镜用在具有有限校正系统所需镜筒长度以外的显微镜上，或者通过将光学元件（例如滤光片）引入到此类系统的会聚光束路径中，则可能发生这种情况。

球面像差的校正需要仔细关注物镜外部的成像介质，这也是性能下降的另一个潜在原因。物镜的特性由设计决定，不能指望它能够适应所有操作条件（校正环提供的调整除外）。可能导致球面像差显著增加的因素包括物镜和标本之间的浸镜油质量差、非标准盖玻片厚度、标本安装封装介质和标本本身。进入在标本和物镜前透镜前表面之间的任何材料物质都将成为成像系统的关键组成部分。在数值孔径较高的情况下，遵守物镜的设计要求变得更加重要。盖玻片厚度或折射率的变化会增加球面像差，特别是在使用“干式”（非浸式）物镜的情况下。高数值孔径的干式物镜通常设计为使用厚度0.17毫米的盖玻片，将标本直接安装在其下并与玻璃接触，以达到出色性能。

为了在使用非标准盖玻片厚度时能够校正球面像差，许多物镜都配备了一个可调节的校正环，以进行各种厚度设置。校正环通过移动内部透镜组来改变物镜的焦距。即使使用正确厚度的盖玻片，玻璃和标本之间也存在一层安装封装介质，这将导致偏离理想的光学状况，并增加球面像差的程度。校正环还可以用于减少由此种性质折射率变化引起的球面像差，因为在共焦显微镜中，由于轴向焦点移动，会导致针孔处的强度光强降低，深度辨别力深层分辨率下降。

油浸物镜通常在优化后，可与厚度为0.17毫米且在特定波长下折射率为1.518的盖玻片，以及折射率得到准确定义的具备准确折射率的浸镜油组合使用。通过指定与明确盖玻片和浸没介质相关的操作条件，可以借助通过设计物镜设计针对几个波长值（取决于物镜的类型）进行球面像差校正。在整个光路（从标本和安装封装介质到物镜前透镜元件）中匹配每种材料间物质折射率的重要性不言而喻，历来都是最难达到的成像标准之一，尤其是试图针对生物标本实现高分辨率的情况下。亚细胞组分的折射率显著低于传统浸没介质，在许多情况下，这些折射率是不确定的，而且在整个标本中也并不相同一致。即使在固定材料中，安装封装介质的折射率通常也与可用浸镜油的折射率不同。

对于在生理盐水溶液中培养和维持的活细胞的动态过程研究，油和水折射率的不匹配导致油浸物镜性能严重受限。其主要问题在于水的折射率（1.33）与浸镜油的折射率（约1.5）不匹配，因此无法发挥最高数值孔径油浸物镜的所有潜能。共焦显微镜应用中的一个关键因素是改进了较厚标本的荧光成像和三维再现，而且当油浸物镜与含水标本组合使用时引入的球面像差限制了进入介质的深度，从而可以获得可接受的图像。通常，高数值孔径油浸物镜设计用于盖玻片下方不超过15至20微米的图像平面。然而，当用于含水标本时，水与盖玻片界面处引发的球面像差可以在低至10微米的深度达到显著水平。例如，图3中所示的点扩散函数表明，在0至8微米的穿透深度范围内，平场复消色差油浸物镜的球面像差程度在增加。

显微镜制造商对利用共焦荧光技术从含水生物标本中收集三维数据很感兴趣，也是其推出大量高数值孔径、高校正水浸物镜的主要动机。但水有两个缺点：它很容易变干，因此对于长时程延时成像来说不切实际；它的折射率很低，只有1.33，不能与高数值孔径物镜组合使用。因此，出于此目的，制造商推出了硅油浸入式物镜，其折射率为1.4，与活细胞的折射率非常接近，并且不会变干。使用油浸物镜时，球面像差是活细胞共焦研究所面临的一个主要光学限制，其影响程度与水介质的观察深度和可变亚细胞组分的变化相关的观察深度成正比（见图3）。对成像的负面影响包括对比度和信号强度的损失，因为一些到达探测器针孔的发射荧光强度的分数降低、微小标本特征信息的分辨率降低且z轴位置准确度降低，这影响了三维图像重建的完整性。通过使用硅油浸入式物镜，在盖玻片下的水介质中对标本进行成像时，可以避免或减少球面像差退化的负面影响，从而发挥共焦技术的全部优势。具有长工作距离的硅油浸入式物镜能够在水介质中超过200微米的深度处收集准确的三维数据。

无论光学校正程度如何，油浸物镜都不是水浸标本成像的合适选择。只有在与盖玻片直接接触的标本区域，这种组合才能获得合适的图像质量。在更大深度处，受球面像差的影响，对比度和分辨率会下降，且图像亮度降低，使得共焦信噪比大幅下降。当在水介质中进行远距离成像时，最大限度减少球面像差的合适解决方案是使用高度校正的硅油浸入式物镜。

在水浸物镜和硅油浸入式物镜上使用校正环是校正球面像差的策略之一。这些调整环为球面像差提供可变校正，例如由盖玻片厚度不一引起的球面像差。这种类型的校正环还可用于补偿生理介质基质以及细胞和组织成分中的折射率差异，以及折射率随温度或溶质浓度变化而产生的变化。由于各种因素都可能诱发球面像差，即使采用合适厚度的盖玻片，可调校正也是共焦应用物镜的优势功能。

轴外光学像差

被称为彗差的常见光学像差主要影响远离光轴的点状源，产生像点的条纹状径向畸变，其严重程度随视场角而增加（见图4）。彗差与球面像差有些类似，因为两者都有可能由相同的因素引起。在现代光学系统中，通过使用合适的透镜元件，通常可以很好地校正这种像差，而能够消除彗差和球面像差的物镜被归类为消球差物镜。由于彗差主要是一种轴外像差，所以其对共焦激光扫描系统具有重要意义，该系统通常使用轴外光束路径，而标本扫描（轴上）共焦显微镜则没有这一问题。

另外几种类型的几何像差对共焦物镜的性能也可能具有重要影响，由于所有这些像差在远离中心的像场区域中更为明显，因此更可能影响激光扫描共焦系统的性能。共焦成像的光学要求是，只有高度校正的光学系统才可能充分发挥作用，并且在这类物镜中，通常已将显著几何像差降至最低。然而，意识到这些像差及其在选择物镜时可能带来的潜在问题很有必要，特别是需要牺牲特定性能特征，以优化特定应用中另一个可能更重要的变量时。

未校正的像散会降低图像强度、清晰度和对比度，与光轴的距离越大，影响越大（图4）。像散像点的几何形状可通过考虑两个正交平面来定义，即通过图像波前波阵面的横截面。像散系统中的平面（子午面和弧矢面）可能有不同的焦距，并且对于完全对称的标本点显示出不同的半径。这种像差导致位于轴外位置的对称点状特征在图像平面中径向或切向拉长，具体取决于焦点。当选择的焦点位于两个极端之间的折中位置时，产生的艾里圆盘斑是不对称的，这会导致图像质量下降。像散是由低质量劣质或受损物镜中无法正确居中聚焦的器件所致，并且会因显微镜光路中的其他错位而加重。

描述为场曲率或场平整度的物镜属性也是共焦成像的一个主要关注点，以实现更宽视野成像，特别是组织切片。简单的球面透镜可将平面标本上不同区域的图像点聚焦到一个弯曲的像面上，其反映的是透镜表面的形状。平坦的像面与弯曲的聚焦平面不匹配，其结果是视野的中心和周边区域不能同时清晰聚焦。由多组透镜元件组成的更复杂的透镜设计很有必要，可以校正这一场曲率，并扩大中央锐清晰聚焦区的大小。被指定为平场或平面的物镜经过光学校正，在中间像面产生一个很宽的可用视野，从中心到边缘都很清晰，而且场曲率最小。最终像面的视场平整度还取决于中间光学元件，包括显微镜目镜。

从像场中心到边缘的放大倍率呈非线性关系，这导致标本特征几何失真，使其真实尺寸轮廓在图像中出现偏差。如果存在这一情况，当正交的交叉线组成像时，很容易观察到这种效果，并且这些线不是在整个像场上看起来笔直，而是在远离场中心的区域处向外或向内弯曲。这两种类型的失真通常被称为桶形和枕形失真。与场曲率的情况一样，少量的几何失真在生物应用中通常不太重要，但在材料科学研究中，如果要进行缺陷分析或准确测量，则可能至关重要。

色差

色差由两种基本光学现象引起，表现出波长依赖性，可能导致不同类型的图像缺陷。一种类型的色差是由于所有光学玻璃的折射率随波长变化而引起，第二种则是由于放大倍率随波长的变化而产生。对于不同波长的光线，由于折射率对波长的依赖性（通常称为色散），会产生有效焦距差。因此，对于一个由单一玻璃组成的简单透镜来说，只有一个波长（或一个狭窄的波长范围）可以通过特定的焦点设置调焦准确地聚焦在像面上。其他波长将聚焦在离透镜更近或更远的地方。由此产生的沿光轴的光谱色散被称为纵向色差或轴向色差（见图5）。对于在光轴上成像的点状光源，折射率的变化导致蓝光集中在离透镜最近的地方，而较长的波长将汇聚在逐渐远离透镜的焦点。如果不加以校正，当图像散焦到光学焦点的两侧时，这种像差可能会被视作不同的颜色条纹。

用于共焦显微镜的物镜中未校正的纵向色差会产生深远严重的影响，特别是在对两个或更多的荧光团成像时，而这取决于在几个波长上显示荧光发射的共焦的能力不同波长的荧光共定位的能力。当使用多个荧光团时，纵向色差会导致各种不同的激光激发光束集中在标本的不同点上，并同样导致非共位的不同发射光被一起采集从非重合点收集不同的发射波长。这种失真否定了使得在z方向建立准确的荧光团位置以生成三维标本数据的可能性难以实现。

在扫描共焦技术中，评估色差对特定物镜图像完整性的影响需要考虑所有决定通过针孔并被探测器记录的确定信号能量的所有因素。这些因素包括激发激光的发射光谱、每个荧光团的发射峰值和带宽，以及探测器的光谱灵敏度。纵向色差的校正通常在物镜设计中通过具有不同光学特性的多个透镜元件的组合来完成，并且根据校正程度，可将物镜分类为不同的类别（如下所述）。

透镜焦距随波长变化，产生了以纵向色差为特征的轴向色散，而这也是导致横向色差发生的原因（见图5）。因为放大倍率与焦距成反比，焦距随波长的变化产生导致了放大倍率对随波长的变动相应依赖。如果这种物镜像差没有得到校正，则图像中的尖锐边缘可能会被红色或蓝色等彩色边缘所包围。在未校正的物镜中，信号中蓝色波长部分的放大倍率可能与红色部分的放大倍率相差约1%至2%。当共焦扫描光学系统存在横向色差时，会导致针孔处的信号损失，因为根据光的光谱组成，发射的光可能会在距光轴较近或较远的位置成像。

由于这两种类型的色差是相关的，针对纵向色差进行高度校正的物镜通常也表现出最小的横向色差。为校正影响光学性能的各种因素，不同显微镜制造商采取了不同的方法，精心搭配系统部件对于获得最大像差校正至关重要。在共焦荧光显微镜中，未校正的横向色差会导致与纵向色差类似的问题，即在绘制确定不同波长的荧光团位置时产生错误。

在光学显微镜的制造历史中，大多数时候都会遵循物镜设计的标准原则，要求物镜在距离物镜安装面的特定固定距离上形成真实的图像，与目镜的前焦平面相对应。基于物镜直接形成真实中间图像的配置称为有限远系统，而到中间图像的距离称为物镜的镜筒长度。虽然各制造商一度将其有限光学系统标准化为相同的镜筒长度和齐焦距离，并采用不同的方法来补偿透镜像差，但如果要将不同制造商的光学元件结合使用，则必须考虑这一因素。有限系统可能会被设计成在物镜中提供完全像差校正，或者在物镜形成的图像中允许有一个已知的残留水平残余的横向色差，由目镜进行补偿。

在无限远光学系统中，离开物镜的光线不会聚焦，而是保持平行，直到被镜筒透镜（偶尔也称为telan透镜）汇聚于中间像面。大多数主要显微镜制造商都开发了无限远校正光学系统，其固有的优点是来自物镜的光线可以聚焦到无限远，对放置在物镜和镜筒透镜之间的“无限远空间”中的附加光学元件相对不敏感。尽管镜筒透镜可以对残余像差进行一些校正，但在多功能设计方面有优势，可提供物镜内完全校正，而且镜筒透镜在光学上是中性的。图6是典型的正置和倒置荧光显微镜的无限远光路。每个显微镜图中的白色双向箭头表示物镜后孔径和镜筒透镜之间的平行光路。

不同的制造商在其无限远系统中采用不同的设计规格，包括镜筒透镜的焦距和无限远空间的长度。无限远校正光学系统允许移动物镜进行聚焦，而不是移动显微镜载物台，对于需要在观察过程中精细操作标本的应用来说，是一个非常明显的优势。然而，无限远空间的主要实用优势在于，可以添加辅助光学元件，例如偏振光分析仪、滤波器和微分干涉对比度（DIC）棱镜，而且不必考虑其折射特性或厚度。只要它们有平面平坦平行的表面，添加的元件对图像质量的影响即可忽略不计。相比之下，光学元件无法放置在有限远校正系统的光束路径中，该系统集中在物镜和中间像面之间会聚，根据所添加元件的厚度和折射率变化，将出现相应的图像偏移和其他像差。

显微镜物镜的光学校正

无论采用有限远或无限远校正光学系统，在确定哪些物镜满足特定成像技术的要求时，必须考虑专为系统设计的物镜的综合性能标准。物镜通常根据其光学校正的程度划分为不同的性能类别。如上所述，各种像差的相对重要性和受其影响的性能标准取决于物镜的使用方式和应用场景的基本要求。最常见的物镜分组通常基于其色差校正程度，虽然由于光学设计和制造方面的重大技术进步，传统物镜类别最近不再那么界限分明。许多描述性术语仍然有效并被广泛使用，在评估各种可用物镜时，了解所用术语及其与共焦应用的关系非常重要。

色差是因制造透镜的光学玻璃的色散特性所致，通常可组合使用具有不同色散特性的透镜元件对其进行校正。传统上，色差校正最小的物镜归为消色差物镜（见图7），通常由具有“正常”色散的玻璃制成。这种类型的玻璃随着波长的增加，折射率几乎呈线性下降，包括冕光学牌和燧石玻璃。冕光学牌玻璃通常表现出低折射率和低色散，而燧石玻璃通常具有高折射率和高色散。在较早的消色差物镜中，这些玻璃类型的两个或多个透镜元件经组合后，可以提供色差校正，使红光和蓝光达到一个共同的焦点，同时还能校正绿光的球面像差。现代消色差物镜通常具有额外的球面像差校正，以及显著的场曲率校正。如果物镜经过校正可以扩大整个像场的平整度，则被归类为平面消色差物镜。一般来说，消色差物镜适用于常规明场目视观察，也适用于显微照相和数码成像，并对场曲率进行额外（平面）校正。

为使物镜实现改进后的色差校正，需要使用在一部分光谱上具有异常色散的玻璃类型。对于在红色或蓝色光谱区折射率随波长呈非线性变化的玻璃，可以抵消色差，以实现两个以上波长的同时聚焦。结晶萤石是人类发现的第一批能够提供适当光学性能的材料之一，可以减少未校正的二级光谱，其导致清晰的边缘附近出现绿色或紫色的条纹，涉及对这是消色差物镜所获图像的特点进行表征的绿色或紫色条纹边缘。与各种光学玻璃组合使用时，萤石元件能够校正三种波长（颜色）的透镜色差和两种波长的球面像差。此外，这种高度校正的物镜在紫外光谱区具有更好的透射特性。

近期的技术发展带来了新的光学玻璃配方工艺和透镜成型能力，其产生的色散特性与萤石元件的色散特性相似，大多数制造商生产的一系列荧光物镜的光学校正已接近最高类别（图7）。这些物镜有时被称为半复消色差物镜，可能包含或不包含萤石元件，但由于其光学特性，不同制造商仍将其命名为Fl和PlanFl。目前，这个类别的物镜有很多配置，包括面向各种浸没介质的型号，非常适合用于明场、荧光、相衬、偏振光和微分干涉对比，以及一些共焦和多光子应用。

被归类为复消色差的物镜通常是那些能够对色差和球面像差进行最高水平校正的物镜（见图7）。对于给定的放大倍率，这些物镜通常具有最高的可用数值孔径，并且至少可对三个波长进行色差和球面像差校正。随着像差几乎完全获得校正，复消色差物镜通常适用于任何显微镜技术，尽管必须考虑所用技术的所有特定具体性能要求。虽然复消色差物镜具有特殊出色的光学校正程度，但由于其使用三重或双重透镜元件，有时会牺牲其他重要的技术规格，例如数值孔径或平整度。新型商业化生产技术通过一种全新的透镜抛光技术克服了这一问题，使超薄透镜元件成为可能。通过结合超薄凸透镜和凹透镜，这些物镜实现了色差校正，在从紫外到近红外的光谱范围内具有更高的透射率、更高的数值孔径和更高的平整度。

如果没有针对激发和发射波长对物镜像差进行类似的校正，则共焦荧光应用会受到严重限制，当使用多个荧光团或当激发和发射波长之间的差异较大时，这一要求更难满足。为了达到最大的检测到最多的光子能量，必须保持照明光斑和针孔成像的检测区域之间的齐焦性能。许多物镜，甚至是复消色差物镜，不能为结合采用紫外光激发和可见光区域发射的荧光技术提供足够的校正。可以在紫外激光源处使用额外的光学元件，针对物镜不能适应宽范围波长进行补偿，尽管这增加了共焦系统的费用，也大大提升了操作的复杂性。

高性能的水浸物镜和硅油浸入式物镜专为满足活细胞成像研究领域的要求而设计。其中主要目标是为了在生物标本的共焦荧光显微镜检查中成像实现出色性能，包括由生理介质提供支持培养的活细胞和组织。必须认识到，无论物镜的设计中纳入了何种程度的像差校正，如果违反设计的操作要求，将额外的像差引入物镜外的光路，将导致合适部件的性能降低。

为直接浸没或浸水而设计的物镜具有专门的陶瓷或聚合物物镜转盘，可用于活细胞和生理学研究。这些研究通常需要接触标本进行测量或其他操作，并且不能在有盖玻片的情况下进行。一般来说，水浸物镜属于萤石类，在紫外和红外光谱区都有很高的透射率，并设计了采用长工作距离的规格设计，物镜转盘插入（浸入）部分的轮廓很窄。物镜头部上较小棱角角度的物镜转盘是为了能够最大限度地接近标本，以便在观察过程中安装微电极或执行其他操作。较长的工作距离（此类型的部分物镜可能为几毫米）也提供了更多接触标本的机会。很多水浸物镜的浸没部分是由陶瓷或其他惰性绝缘材料制成，具有电气隔离和耐化学腐蚀性。这些不同特征相组合，使水浸物镜适合用于活体标本共焦成像、多光子和其他各种成像方法。

除了放大倍率、数值孔径和光学校正程度外，物镜的工作距离在共焦显微镜和其他用于获取三维标本信息的数码显微镜技术中具有特殊意义。对于需要盖玻片的物镜来说，工作距离被定义为当与盖玻片接触的标本平面处于聚焦状态时，盖玻片顶面与前透镜元件之间的距离（图9(b)）。当在标本的不同深度进行共焦成像时，工作距离很重要，因为其决定了在物镜接触到盖玻片顶面之前可达到的最大焦距穿透深度。因此，工作距离限制了沿z轴的行程范围，而此轴主要用于收集标本数据。

举例来说，一个工作距离为0.20毫米（200微米）的物镜，在物镜接触到盖玻片顶面之前，可以聚焦到盖玻片下200微米的最大深度。在一定范围内，工作距离可以通过光学设计来改变，尽管它通常会随着放大倍率、数值孔径和光学校正的增加而缩短。要在长工作距离下保持大数值孔径和高度像差校正，会受到由透镜元件的形状几何学约束和高度校正物镜所需数量所施加的简单几何约束的限制。从各种可用物镜的规格来看，其代表着行业目前通过改进光学玻璃、透镜涂层和计算机设计能力，在物镜性能方面所取得的显著成就。

信号强度与数值孔径的平方成正比这一事实对共焦显微镜的物镜选择有影响，在某些情况下会改变各种性能因素的相对重要性。当使用具有扫描变焦功能的扫描共焦系统时，很少需要使用100倍光学放大倍率，高数值孔径和高度校正的40倍和60倍物镜可能更合适。可以使用较低的扫描变焦获得宽视场图像，使用较高的扫描变焦获得高分辨率的亚细胞结构图像。

许多流行的技术，如免疫荧光成像，固有地不可避免受到如此昏暗光线的影响，因此，光学系统的透射特性至关重要。只有少数光子可用于检测微小的标本细节，因此，荧光团激发或发射波长下的透射百分比的相对较小差异对于确定标记待测物特征的可检测性至关重要。在某些情况下，物镜的透射特性可能比其他规格性能（如场平整度和像差校正）具有更大的意义，这些规格需要额外的透镜元件和涂层，以但会增加临界重要波长带范围中的光损失。然而，光学技术的进步通过独特的透镜制造技术避免了这种透射率折衷降低。

应用于解决细胞和分子生物学以及其他领域问题的专门技术的数量，导致了对光学成像系统的需求的变化，特别是在显微镜物镜方面。用于生物标本的三维研究的共焦扫描技术的研究急剧增加，对已经商业化开发的产品产生了重大影响，尽管诸如激光捕获、多光子激发、荧光共振能量转移（FRET）、荧光原位杂交（FISH）和红外微分干涉对比等方法也引入出现了新的要求。一些专门专业技术的参数使人们认识到，某些传统的物镜性能标准可以降低一些，可能至少可以部分牺牲，以改善提高其他更关键的规格性能。除了抗反射涂层技术之外，计算机辅助透镜设计和光学玻璃配方的显著进步，已经引入了能够满足许多新要求的改进先进光学系统，而在传统的宽场显微镜中很少或没有折衷降低传统宽场显微镜的性能。示例包括具有更高数值孔径的高性能硅油浸入式物镜，以及工作距离增加、具有球面像差校正环和增强紫外和红外透射的物镜。此外，使用超薄透镜制造的物镜使研究人员能够实现高数值孔径、高透射率、更宽光谱范围的色差校正和扩展的平整度，而不降低其中任何性能参数影响任何此类规格。

当根据其设计规格参数使用时，许多现代物镜都适合用于共焦显微镜。使用激光扫描共焦显微镜对较厚的含水标本进行高分辨率检查和准确的三维成像要求特别高，需要一个满足以下所有标准的物镜：高数值孔径以有高效收集荧光，长工作距离以实现最大的穿透深度，平坦的视野以实现准确的三维重建，低轴向色差以实现多个荧光团的准直齐焦，低横向色差以实现多个荧光图像的准确配准，此外，还有激发和发射波长的高透射率光度。